莱菔硫烷对TNF—α诱导bEnd.3鼠脑血管内皮细胞产生IL—1β的影响

   目的 研究莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对TNF-α诱导bEnd.3鼠脑血管内皮细胞IL-1β的影响。 方法 体外培养脑血管内皮细胞系bEnd.3,TNF-α刺激前先用3 μg/mL SFN处理2 h,MTT法检测细胞的活性,ELISA检测IL-1β和血红素氧合酶(heme oxygenase,HO-1)的产生。 结果 (~3) μg/mL SFN对bEnd.3细胞无明显毒性作用。TNF-α能显著诱导bEnd.3细胞产生IL-1β,并能表达一定量的HO-1。经SFN处理后,HO-1表达量增高,且IL-1β产生明显降低。此外,HO-1激动剂CoPP处理能协同SFN降低TNF-α诱导的IL-1β产生,HO-1抑制剂ZnPP能减弱SFN对IL-1β的抑制作用。 结论 SFN通过上调HO-1的产生从而抑制TNF-α诱导bEnd.3细胞分泌IL-1β。 
关键词 莱菔硫烷;脑血管内皮细胞;血红素氧合酶-1;IL-1β 
中图分类号 R741 文献标识码 A 文章编号 1673-971(213)1-1-2 
脑血管内皮细胞是血脑屏障重组成部分,各种因素如缺氧等导致其功能异常后直接引起脑血管通透性增高和血管源性脑水肿,并最终导致脑神经细胞损伤1。脑损伤程度及预后不仅取决于脑缺血缺氧的范围和程度,而且与缺血-再灌注损伤的发生密切相关。其中氧自由基连锁反应是神经元受损的核心病理环节2,3。生理条件下,机体内自由基的生成和清除之间保持动态平衡,但在某些病理生理条件下,自由基产生过多或清除不足时就会造成组织损伤。脑组织由于富含脂质,本身抗氧化作用比较弱,对缺氧的耐受性低,因此最容易受到自由基的攻击。氧自由基一方面直接使脂质、蛋白质过氧化,使细胞发生不可逆改变;另一方面通过刺激细胞因子、黏附分子以及各种炎性相关介质的表达,介导炎症反应从而加重脑组织损伤,最终导致神经元缺血坏死4,3。本研究旨在观察莱菔硫烷对TNF-α诱导血管内皮细胞产生IL-1β的影响,并探讨其可能的作用机制。 
1 材料与方法 
1.1 主材料与试剂 
鼠永生化脑血管内皮细胞系bEnd.3购自ATCC。培养基DMEM、胎牛血清购自Invitrogen;SFN(分子量177. 3,纯度98.3%)购自美国Alexis公司;钴原卟啉 Ⅸ(CoPP),锌原卟啉 Ⅸ(ZnPP)为Sigma-Aldrich产品,HO-1和IL-1β ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。 
1.2 细胞培养与处理 
bEnd.3细胞用含2%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%CO2条件下培养。实验分为正常对照组、TNF-α模型组和SFN干预组。其中对照组仅加入.1%DMSO,模型组细胞加入5 ng/mL TNF-α;SFN不同浓度干预组在模型组基础上分别加入5 μg/mL、1 μg/mL、3 μg/mL SFN,于24 h后收集细胞。 
1.3 细胞毒性实验 
取对数生长期细胞,按8×14/孔接种于96孔板中(2 μL/孔),每组设6个重复孔。SFN孵育结束前4 h各孔加入MTT溶液2 μL(5 mg/mL),随后弃上清,并加入2 μL DMSO,充分混匀,用酶标仪测定各孔的吸光度值(OD57),计算细胞的相对活性,计算公式为处理组OD值/对照组OD值×1%。 
1.4 ELISA 
采用双抗体夹心ELISA法检测细胞培养上清中的IL-1β和HO-1,按照深圳欣博盛生物技术有限公司供的试剂盒操作进行。其检测下限分别为1 pg/mL和5 pg/mL。 
1.5 统计学分析 
采用SPSS 15. 统计学软件处理数据,结果采用均数±标准差(x±s)表示,多组比较采用One-way方差分析并行Student’s t检验,P < .5为差异有统计学意义。  2 结果  2.1 不同浓度SFN对bEnd.3细胞生长抑制率的影响  为了探索SFN唑最佳的作用浓度,本研究采用(~3) μg/mL对bEnd.3细胞的活性进行了观察,结果显示,(~3) μg/mL SFN唑对bEnd.3细胞增殖活性无明显影响(图1),因此随后的实验将用浓度高达3 μg/mL的SFN进行。  2.2 SFN对TNF-α诱导bEnd.3细胞产生IL-1β的影响  TNF-α刺激前,bEnd.3细胞无IL-1β产生。5 ng/mL TNF-α处理后,IL-1β含量明显升高。而1~3 μg/mL SFN能明显降低TNF-α诱导的IL-1β产生,见图2。  2.3 SFN对HO-1表达的影响  ELISA结果显示,bEnd.3细胞未刺激条件下HO-1表达水平较低。TNF-α处理后HO-1表达有所增加;而SFN处理后,与TNF-α相比HO-1表达进一步增高(图3)。  2.4 HO-1抑制剂与激动剂对TNF-α诱导bEnd.3细胞产生IL-1β的影响  HO-1抑制剂ZnPP预处理后,能减弱SFN对IL-1β的抑制作用。而HO-1激动剂CoPP则能进一步协同SFN降低TNF-α诱导的IL-1β产生(图4)。  3 讨论  HO-1是催化血红素裂解为胆绿素、一氧化碳以及游离铁的限速酶,其主有三种同工酶,其中HO-1属诱导型,可被氧应激、重金属离子等多种因素诱导,并已被证明有细胞保护作用5。有研究显示,上调HO-1表达可有效降低氧化应激导致的肺上皮细胞损伤,相应的,HO-1基因缺陷型小鼠对炎症性肺损伤的敏感性大大增高。此外,转染并表达HO-1的小鼠,心肌缺血-再灌注损伤时可有效减少心肌梗死面积。以上研究表明HO-1是心血管疾病的内源性防护系统6。   基于以上依据,抑制氧化应激可能是治疗各种缺血-再灌注导致的脑损伤的重策略。目前临床上已经开发了多种抗氧化剂,并在动物实验中具有一定的疗效,但临床使用过程中又存在诸多缺陷7,8。主包括无法通过血脑屏障、稳定性差、副作用大等缺点。SFN是一种异硫氰酸盐类物质,主来源于十字花科蔬菜。研究表明,SFN是一种Ⅱ相抗氧化和解毒酶的诱导剂,具有抗氧化损伤等多重效应。有研究显示,在很多神经系统急、慢性疾病的动物模型中,SFN被证实有很好的神经保护作用9。但SFN对脑缺血的治疗作用的研究还甚少1。本研究发现,在脑微血管内皮细胞损伤发生的过程中,诱导产生的细胞因子、内皮素等虽然能代偿性引起HO-1表达的增加,但这种代偿往往难以平衡体内氧化还原状态。而在SFN诱导下HO-1表达显著增加。SFN处理后能显著上调HO-1的表达。TNF-α作为一种促炎因子,它和IL-1β表达的增加可诱导血管内皮细胞表达分子间黏附分子和内皮细胞白细胞黏附分子的表达,使大量白细胞在脑实质中聚集、浸润,并释放多种炎症介质加重炎症反应。SFN处理后IL-1β明显减少。这表明SFN对TNF-α诱导bEnd.3细胞产生细胞因子的抑制作用是通过上调HO-1的表达而实现的。  脑血管病不仅是常见的临床急症,而且是严重的社会—医学—经济问题,有效的治疗方法也相当缺乏,因此本研究不但对探索SFN的药理机制具有一定的参考价值,也能为寻找新的治疗方法和有效的干预策略供了一定的参考。  参考文献  1 陈纲,贾兵,刘晔,等. 体外循环对大鼠脑血管内皮细胞功能的影响J. 中华胸心血管外科杂志,29,(5)35-353.  2 皇甫超申,牛保华,席艳. 脑血管内皮细胞损伤对大鼠脑缺血再灌注神经元凋亡的影响J. 河南大学学报医学版,25,24(4)9-1,16.  3 杨雪,郝艳秋. 缺氧缺血性脑损伤中的少突胶质前体细胞死亡通路机制J. 中国优生与遗传杂志,211,19(1)7-9.  4 高峰,崔澂. 颅脑外伤后微循环异常变化及损伤机制J. 白求恩军医学院学报,212,1(3)216-218.  5 谢海辉,陈淼. 血红素氧合酶-1与缺血性脑损伤J. 麻醉与监护论坛,27,14(4)243-245.  6 张志峰,刘绍明,修斌华. 血红素氧合酶-1在脑损伤过程中的作用的研究进展J. 现代生物医学进展,211,11(5)961-963.  7 田伟千,崔苏扬. 异丙酚对缺血性脑损伤的抗氧化应激作用J. 医学综述,21,16(5)742-745.  8 范春,张志华. 依达拉奉治疗急性颅脑损伤34例近期疗效观察J. 陕西医学杂志,21,(9)1148-1149.  9 Chen YT,Shi D,Yang D,et al. Antioxidant sulforaphane and sensitizer trinitrobenzene sulfonate induce carboxylesterase-1 through a novel element transactivated by nuclear factor-E2 related factor-2J.Biochem Pharmacol,212,84(6)864-871.  1 Benedict AL,Mountney A,Hurtado A,et al. Neuroprotective effects of sulforaphane after contusive spinal cord injuryJ. J Neurotrauma,212,29(16)2576-2586.    

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